O Guadiana nasce nas Lagoas de Ruidera, na região de Castilla-La Mancha, Espanha, a uma altitude aproximada de 1.700 metros. Em seguida, o rio surge (renasce) nos Ojos del Guadiana e desagua no Oceano Atlântico, no golfo de Cádis, entre Vila Real de Santo António (Portugal) e Ayamonte (Espanha). A bacia hidrográfica é partilhada entre os dois países e o rio percorre cerca de 829–830 km, funcionando como fronteira natural entre Portugal e Espanha em vários trechos, especialmente entre o Caia e a ribeira de Cuncos, e entre o Chança até à foz. A jusante de Portugal, o Guadiana é navegável até Mértola, e em Portugal existe a Barragem de Alqueva, que cria o maior lago artificial da Europa.